Eine durch eingefügte Mutationen besonders aktive humanen Thymidinkinase (super TK1), kann selektiv zur Gentherapie von Tumoren eingesetzt werden. Eingebracht in die Krebszellen wirkt sie unmittelbar zytostatisch auf die Zellvermehrung durch eine Hemmung der DNA-Synthese. Das superaktive Enzym produziert in den Zielzellen im Übermaß Desoxythymidinmonophosphat aus zugesetzem Desoxythymidin (dTh) und hemmt auch nachhaltig weitere Nukleotidstoffwechselwege.
Eingereicht von: Mag. Dr. Reinhold Hofbauer
Firma/Universität: Medizinische Universität Wien – Zentrum f. Med. Biochemie, Abt. f. Mol. Genetik
Homepage: www.meduniwien.ac.at; www.mfpl.ac.at
Das Forschungsteam um Mag. Dr. Reinhold Hofbauer hat sich intensiv mit der in vitro Mutagenese der humanen Thymidinkinase (TK1) befasst und eine ganze Reihe von überaktiven, wie auch schwach aktiven Mutanten hergestellt. Eine besonders aktive so genannte superTK1 wird nun als nebenwirkungsfreie, zytostatisch/-toxische Funktion zur Gentherapie von soliden Tumoren eingesetzt. Dabei kann dieses rekombinante Gen, integriert in das eukaryotische, plasmidbasierendes Expressionssystem pUHD10.3Hyg transfektiert, oder in ein vom Adeno-assoziierten Virus abgeleitetes Expressionssystem pAAV in Tumorzellen infiziert werden. In den Zielzellen wird die Expression nach Doxycyklingabe (tet-Promoter) sehr stark induziert. Durch die nachfolgende enorme superTK1-Expression in den Tumorzellen wird ein unmittelbarer Wachstumsarrest (→Thymidinblock am Beginn der S-phase) verursacht. In weiterer Folge entsteht daraus auch eine zytotoxische Wirkung für die betroffenen Tumorzellen. Da die superTK1 bereits mit sehr niedrigen Desoxythymidin (dTh) – Konzentrationen (0,1 mM dTh) eine ausgeprägte Hemmwirkung erzielen kann, entsteht für den restlichen Organismus und auch nicht transfektierte, sowie auch nicht proliferierende Zellen keine therapeutische Belastung (nebenwirkungsfreie Gentherapie). Bei erfolgreichen Hemmexperimenten mit superTK1 tragenden primären Carcinomazellen (PC-3 = Prostatacarcinom; MFM-223 duktales Mammacarcinom) aber auch mit HeLa Zellen (humane Cervixcarcinomzellen) konnten wir die wirksame Hemmkonzentration von 0,1 mM dTh allein, oder in Kombination mit jeweils einem der zytostatisch wirkende Nukleosidanaloga Cytarabin (Cytosin-β-D-arabinofuranosid) und/oder 5-FU (5-Fluorouracil), um das 50-80-fache im Vergleich zum Ausgangsniveau senken ( 5 µM AraC/5-FU). Auf Grund dieser beobachteten Synergien wird eine Kombinationstherapie von dTh mit einem Zytostatikum dieser Substanzklasse bei sehr geringen Wirkkonzentrationen ebenfalls eröffnet. Diese Aspekte ermöglichen eine neue, innovative Form der superTK1 basierenden Gentherapie zu etablieren. Im Rahmen dieser Forschungsarbeiten soll die zytostatische/ -toxische Wirksamkeit der superTK1 mit humanen Tumorzellen Xenografts in SCID-Mäusen untersucht werden.
Idealerweise werden dabei in einem ersten Ansatz superTK1 tragende PC-3 und MFM-223 Zellen als Xenografts in SCID-Mäuse implantiert. Nach ca. 10 Tagen Anwachszeit der künstliche gesetzten Tumore (MFM-223 im Brustbereich, PC-3 im Peritoneum) sollen die gentherapeutischen, stabil in die Krebszellen integrierten Expressionssysteme über Doxyxcyclin (Trinkwasser) im Tumor induziert werden. Die dabei notwendigen Therapeutika (allein und in Kombination: dTh, 5-FU, AraC) werden über implantierte osmotische Minipumpen permanent an die Versuchstiere abgegeben. Nach 3 Wochen Therapiedauer werden die Erfolge der Gentherapie histologisch und molekurlabiologisch untersucht. Dadurch können wir einen Therapieansatz von soliden humanen Tumoren im Tiermodell etablieren und erproben. Das Vektorsystem der Wahl für die tatsächliche Therapie von soliden Tumoren ist das virale Expressionssystem pAAV, in dem die superTK1 integriert mittels Infektion in die Zielkrebszellen gelangt. Letztere ist nicht abhängig von der Art der Tumorzelle, somit sind alle Tumorzelltypen gleich gut erfassbar und bei einem guten Virustiter im Gentherapeutikum (>107 Viruspartikel/ml). In diesem Teil der Studie sollen noch die humane Glioblastomzelllinie T98G und die Neuroblastomzelllinie SHSY5Y als Zielzellen integriert werden. Im Rahmen der laufenden Forschungsarbeiten wird die helfervirusfreie Verpackung, sowie die Applikation (mikrochirurgische Infiltration) in humane Xenotransplantate im Mausmodell weiter optimiert werden.